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生物樣品掃描電鏡概述
更新時間:2024-08-01   點擊次數(shù):511次
   掃描電鏡(SEM)作為現(xiàn)代生物學(xué)研究的重要工具,能夠高分辨率地展示細胞、組織等生物樣品的表面形貌和結(jié)構(gòu)細節(jié)。

  一、生物樣品掃描電鏡具體步驟

  樣品準(zhǔn)備

  取材:根據(jù)研究目的準(zhǔn)確取材,確保樣品具有代表性且體積不宜過大,一般不超過8mm×8mm,厚度不超過5mm。對于易卷曲的樣品如血管、胃腸道粘膜等,需固定在濾紙或卡片紙上以充分暴露待觀察的表面。

  固定:樣品需進行雙固定處理,先用1%-3%的戊二醛/緩沖液在室溫或4°C下前固定,時間根據(jù)樣品特性而定。隨后用1%餓酸/緩沖液在4°C下進一步固定。固定過程旨在保持樣品的形態(tài)和結(jié)構(gòu)。

  清洗:對于表面凹凸不平或有雜質(zhì)的樣品,在固定前后需進行清洗,以去除雜質(zhì),避免影響成像質(zhì)量。

  脫水與置換

  逐級脫水:樣品需經(jīng)系列濃度的乙醇或丙酮逐級脫水,一般從30%、50%、70%、80%、95%至100%,每步處理10-15分鐘。

  置換:用乙酸異戊酯置換100%乙醇,室溫下放置20分鐘以上,以減少樣品在干燥過程中的收縮和變形。

  干燥

  干燥方法多樣,包括臨界點干燥、空氣干燥、化學(xué)藥品干燥和冷凍干燥等。干燥過程需確保樣品表面形貌不被破壞,且樣品需干燥無水、無易揮發(fā)溶劑,以避免對電鏡造成損傷。

  導(dǎo)電處理

  噴涂導(dǎo)電膜:在真空條件下,對樣品表面噴涂10-20nm厚的金或鋁膜,以增強樣品的導(dǎo)電性,確保電子束能順利釋放二次電子,從而改善圖像的亮度和反差。

  上鏡觀察

  將處理好的樣品放置在掃描電鏡的樣品臺上,調(diào)整樣品高度至距電子槍既定距離(一般約10mm)。

  啟動掃描電鏡,設(shè)置加速電壓、放大倍數(shù)、掃描速度等參數(shù),通過控制器和電腦對樣品進行觀察,獲取樣品的形貌和結(jié)構(gòu)信息。

  二、檢定過程中需要注意的事項

  樣品準(zhǔn)備質(zhì)量

  確保樣品制備過程中的每一步都精細操作,避免對樣品造成機械損傷或化學(xué)污染。

  固定、清洗、脫水和干燥等步驟需嚴(yán)格控制時間和條件,以保證樣品的形態(tài)和結(jié)構(gòu)不被破壞。

  電鏡操作環(huán)境

  保持操作環(huán)境清潔無塵、無震動、無電磁干擾,以保證掃描電鏡的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性。

  定期清潔和維護電鏡設(shè)備,確保其長期穩(wěn)定運行。

  參數(shù)設(shè)置與校準(zhǔn)

  根據(jù)樣品的特性和觀察需求合理設(shè)置掃描電鏡的參數(shù),如加速電壓、放大倍數(shù)等,以獲得最佳的圖像質(zhì)量和分辨率。

  在觀察前進行必要的校準(zhǔn)操作,如調(diào)整電子束的掃描速度和掃描模式等,以確保圖像的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

  樣品導(dǎo)電性

  對于非導(dǎo)電樣品,噴涂導(dǎo)電膜是一步。導(dǎo)電膜的厚度需適中,既能改善圖像質(zhì)量又不掩蓋樣品結(jié)構(gòu)。

  對于某些無法噴鍍導(dǎo)電膜的樣品,可采用低真空模式觀察以緩解荷電效應(yīng)。

  安全注意事項

  在操作過程中佩戴干凈無粉手套,避免直接接觸樣品和設(shè)備以減少污染。

  注意個人防護措施,避免長時間暴露在電子束輻射下。

  遵守實驗室安全規(guī)程,確保設(shè)備和人員的安全。

  綜上所述,生物樣品掃描電鏡技術(shù)涉及多個精細步驟和注意事項。只有嚴(yán)格按照操作規(guī)范進行樣品準(zhǔn)備和檢定過程,才能獲得高質(zhì)量的觀察結(jié)果并確保電鏡設(shè)備的長期穩(wěn)定運行。隨著技術(shù)的不斷進步和應(yīng)用領(lǐng)域的擴展,掃描電鏡將在生命科學(xué)研究中發(fā)揮更加重要的作用。

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